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第七章 HIV-1基因型耐药检测

1  范围

  本章规定了HIV-1基因型耐药检测的意义、检测方法、结果报告及质量控制要求,适用于从事HIV-1基因型耐药检测的各级实验室。 

2  规范性文件引用

  《病原微生物实验室生物安全管理条例》(中华人民共和国国务院令第424号,20041112日)。 

  卫生部关于印发《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的通知(卫办医政发2010]194 

  Update of the Drug Resistance Mutations in HIV-1.Top HIV Med,2014. 

  HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》,(中国疾病预防控制中心,2013年版)。 

  Global Strategy for the Surveillance and Monitoring of HIV Drug Resistance, WHO, 2012. 

  HIV耐药监测策略和检测技术》人民卫生出版社,2010年。 

  《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册(第三版)》(人民卫生出版社,2012年)。 

  Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1-Infected Adults and Adolescents. DHHS, USA, 2015. 

3  HIV-1基因型耐药检测的意义

3.1  群体耐药监测

  3.1.1治疗前人群的耐药监测  

  在开始抗病毒治疗前进行基因型耐药检测,了解从未服用抗病毒药物的治疗前人群、曾服用抗病毒药物的治疗前人群如暴露前/后预防人群和母婴阻断的母亲的耐药情况,可作为制定一线抗病毒治疗方案的参考依据。 

  3.1.2获得性耐药监测  

  在抗病毒治疗12个月或以上的人群中进行基因型耐药检测,了解耐药突变比例和模式,分析耐药发生的影响因素,可作为制定二线治疗方案和耐药发生的措施的参考依据,指导和完善公共卫生模式抗病毒治疗的程序。 

  3.1.3婴幼儿耐药监测  

  18个月龄下的新诊断婴幼儿中行基因型耐药检测,分析母婴阻断后HIV感染婴幼儿的耐药情况,可作为制定母婴阻断和婴幼儿抗病毒治疗方案的参考依据。 

  3.1.4传播性耐药监测  

  新近感染人群中的耐药性监测,了解耐药毒株流行的情况,可为制定耐药传播的措施提供参考依据。 

3.2  个体耐药检测

  3.2.1抗病毒治疗前 

  在抗病毒治疗前进行耐药检测,可辅助临床医生制定抗病毒治疗方案,保证抗病毒治疗的效果。 

  3.2.2抗病毒治疗过程中 

  病毒学失败或治疗效果不理想时,进行基因型耐药检测,可辅助临床医生分析治疗失败的原因,并制定补救治疗方案。 

  3.2.3在抗病毒治疗中断1个月以上、病毒载量小于500-1000拷贝/毫升时不推荐进行常规基因型耐药检测。 

4  HIV-1基因型耐药检测实验室要求

  HIV-1基因型耐药检测应在合适的实验室中进行,严格满足分子生物学和PCR扩增实验室的要求。 

4.1  实验室功能分区

  HIV基因型耐药检测实验室应参照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》附件中医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》的要求进行。实验室原则上应分为4个独立工作区:试剂准备区、样品处理区、扩增区、扩增产物分析区,并设在不同房间。前两区为扩增前区,后两区为扩增后区。 

4.2  实验室人员和要求

  HIV-1基因型耐药检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格,接受过省级以上的实验操作技术培训或厂家的培训,并接受实验室生物安全培训。 

4.3  设施和设备

  根据检测项目配备相应的设施和设备,并定期对相关仪器和设备进行校验。 

5 HIV-1基因型耐药检测方法及程序

5.1样品

HIV-1基因型耐药检测可使用血浆、血清、滤纸片干血斑等样品,其中血浆样品采用抗凝剂EDTA(乙二胺四乙酸)或ACD(枸橼酸钠),不要使用肝素,肝素是Taq酶的强抑制剂,且在核酸提取过程中很难除去。 

5.2检测原理

常规HIV-1基因型耐药检测采用RT-PCR扩增和Sanger测序法获得相关基因片段的序列,通过与野生型和耐药毒株的序列比较,分析耐药相关基因突变,利用基因型耐药解释系统判断是否耐药以及耐药的程度。 

5.3  检测方法

  目前我国HIV-1基因型耐药检测采用商品化试剂盒和实验室自建(In-house)两种方法。 

  5.3.1 ViroSeq™是美国FDA批准的HIV-1基因耐药检测方法,使用血浆样品、病毒载量范围为2000750000 CPs/毫升;利用一轮RT-PCR扩增1.8kbpol区片段,覆盖完整蛋白酶区(1-99位氨基酸)和部分逆转录酶区片段(1-335位氨基酸)的基因区域;采用正反向的7条引物进行测序,通过系统自带的软件行序列编辑和拼接,以HXB-2作为参考序列得到待检样品的耐药相关突变位点和耐药程度的报告。 

  5.3.2 实验室自建(In-house)方法一般使用套式PCR方法行两轮扩增。应根据所测目的基因的序列设计引物,包括逆转录、PCR扩增和测序引物。根据《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》,目前临床上常用的药物有三大类,分别为:蛋白酶抑制剂(PIs)、核苷类或核苷酸类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)。针对这三类药物,耐药基因型检测需扩增HIV-1pol基因区,目的基因片段应至少覆盖蛋白酶区4-99位氨基酸和逆转录酶区38-248位氨基酸的基因区域。 

5.4  耐药分析

  5.4.1 将所测样本序列与数据库中的参考序列或共享序列进行比较,判断是否出现耐药相关的基因突变。 

  5.4.2 根据HIV-1基因型耐药解释系统的规则来评判对特定药物的耐药程度。 

  5.4.2.1 商业化试剂盒使用与试剂盒配套的HIV-1基因型耐药检测的解释系统。 

  5.4.2.2 In-house方法通常使用HIVDB系统(http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra),判断耐药相关突变和组合的耐药程度。 

  5.4.2.3判断在新近感染人群中是否存在传播性耐药突变,使用 CPR工具(CPR, http://cpr-v.stanford.edu/cpr/servlet/CPR)。 

  5.5  结果报告和解释 

  5.5.1  耐药相关的基因突变 

  应分基因区报告耐药相关的基因突变,如将蛋白酶(PR)和逆转录酶(RT)两个基因区的基因突变分开报告(见附表8)。基因突变以“字母-数字-字母”的书写方式来表示,第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸,第二个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸。 

  5.5.2  耐药程度分析 

  ViroSeq试剂盒将耐药程度分为敏感(S)、可能耐药(I)和显示耐药(R)三个水平,其中后2个水平为耐药。HIVDB系统将耐药程度分为敏感(S)、潜在耐药(P)、低度耐药(L)、中度耐药(I)和高度耐药(H)五个水平,其中后3个水平为耐药。 

  5.5.3  当耐药毒株在个体内病毒群体中的比例低于1020%时,通常检测不到其存在,因此未检出耐药时,只可报告本次实验结果为“未发现耐药”,不可报告为“敏感”。 

6  质量保证与质量控制

  质量保证的目的是持续为监测及检测提供准确可靠的检测结果。 包括从样品接收到发出检测报告的全过程。质量控制包括室内质量控制(室内质控)和外部质量控制(外部质控)。 

6.1  室内质控

6.1.1  检测过程质量控制 

  6.1.1.1 使用商品化试剂盒时,需按照要求加入试剂盒提供的阳性对照和阴性对照质控品。 

  6.1.1.2  In-house方法除待测样品外,还应设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为与待测样品同质、含有目的基因片段的样品;阴性对照为与待测样品同质、不含有目的基因片段的样品;空白对照为不含模板的扩增试剂。 

  6.1.1.3  从样品核酸提取开始加入阴性和阳性对照,每次检测应至少加入一个阴性对照和一个阳性对照,建议阴性对照与待测样本的比例不小于122 ,其中阴性对照应随机放置在待检样品中。从RT反应开始加入空白对照。 

  6.1.1.4  将同一批次和上一批次检测所产生的序列,以及阳性对照序列进行比对,并构建分子进化树。 

  6.1.1.5  只有在阳性对照扩增出预期片段,阴性对照和空白对照没有任何扩增片段,并且分子进化树分析没有交叉污染的情况下,实验才成立。 

  6.1.2  试剂质量控制:试剂批号变更时,可增加阳性对照数量,将本次试验阳性对照的结果与已知结果进行比较,以检验试剂的可靠性和稳定性。 

  6.1.3  定期进行实验室内部质量评价:随机选择经耐药基因型检测过的样品,送实验操作者进行盲样检测, 比较序列以及耐药位点图谱。扩增效率低、序列或耐药位点不一致,表示测定的重复性差,应检查所有的实验步骤,进行质量控制。 

6.2  外部质控

  开展HIV-1耐药检测的实验室每年至少接受二次国家级实验室能力验证(PT),通过考核后方可进行检测。有条件的实验室可参加国际认可机构的质控,具体参见HIV-1基因型耐药检测及质量保证指南》。 


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