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第八章 CD4+和CD8+T淋巴细胞检测

1 范围

  本章规定了CD4+CD8+T淋巴细胞检测的意义、检测方法、结果报告及质量控制要求。适用于从事相关检测的各级艾滋病检测实验室。 

2 规范性文件引用

  《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》(中华人民共和国卫生行业标准,有效版本)。 

  《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册(第三版)》(人民卫生出版社,2012年)。 

  艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测及质量保证指南(试行)》(中国疾病预防控制中心,20138月)。 

  《病原微生物实验室生物安全管理条例》(中华人民共和国国务院令第424号,20041112日)。 

  《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》(中华人民共和国卫生行业执业标准 WS/T360-2011)。 

  Laboratory Guidelines forenumerating CD4 T Lymphocytesin the context of HIV/AIDS.World Health organizaion  Regional Office for South-East Asia New Delhi, June 2007. 

3  CD4+ 和CD8+T淋巴细胞检测的意义

3.1  HIV感染临床分期

  CD4+T淋巴细胞数量可评价HIV感染者免疫状况,辅助临床进行疾病分期。我国《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》(中华人民共和国卫生行业标准,WS293-2008)将CD4+T淋巴细胞值作为成人及15岁(含15岁)以上青少年HIV/AIDS临床分期标准的主要依据之一。 

3.2  HIV感染儿童免疫抑制分级和治疗辅助指标

  CD4+T淋巴细胞百分数可以作为儿童免疫抑制分级指标, 可以作为儿童临床治疗分期和辅助条件。 

3.3  疾病进展监测

  《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册(第三版)》推荐对无症状HIV感染者及CD4+T淋巴细胞计数高的感染者每年进行一次CD4+ T淋巴细胞计数检测以评估疾病进展,判断预后状况;对接受抗病毒治疗患者,每六个月进行一次CD4+T淋巴细胞计数检测,评估治疗效果。 

3.4  机会性感染的风险评估

  机会性感染是艾滋病患者死亡的主要原因,CD4+T淋巴细胞可评估HIV感染者机会性感染的风险,辅助判断是否进行预防性治疗(如当CD4+ T淋巴细胞<200/μl时,应给予抗肺孢子菌肺炎的预防性治疗。 

3.5  抗病毒治疗适应症选择及疗效评价

  《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册(第三版)》将CD4+T淋巴细胞数量作为是否开始抗病毒治疗的重要实验室指标之一,并规定治疗后定期检测CD4+T淋巴细胞数量,判断免疫系统恢复情况。

3.6  CD8+T淋巴细胞为抑制性/细胞毒性T细胞,HIV感染者CD8+T细胞数量增加,导致CD4/CD8比值下降。

  4  CD4+ 和CD8+T淋巴细胞检测实验室要求 

 

4.1 人员

  4.1.1  进行HIV/AIDS患者CD4+T淋巴细胞检测人员应接受过省级以上艾滋病实验室安全、检测技术和质量控制培训以及仪器厂家提供的培训。 

  4.1.2  进行HIV/AIDS患者CD4+T淋巴细胞检测的人员须具有上岗资格,正式检测患者样品前,应检测一定数量的样品或者质控品,将检测结果与省中心实验室结果进行比对,由确证中心实验室评价其检测能力,检测结果准确、稳定后方可检测。 

  4.1.3 CD4+T淋巴细胞检测的管理人员和检测人员接受实验室生物安全责任人和实验室管理人员的监督。 

  4.1.4  实验室的安全责任人要对工作秩序和环境的安全负责,所有工作人员都有责任保护自己和他人的安全。 

4.2  功能分区

  实验室原则上应分为样品准备区和样品检测区,各区的功能为: 

  样品准备区应达到生物安全级(BSL-2)实验室要求,用于样品制备。 

  样品检测区用于制备好的样品在流式细胞仪上检测。 

4.3  设施和设备

  4.3.1 样品准备区:生物安全柜、离心机、冰箱、恒温孵箱/水浴箱、旋转振荡器、精确移液器(5μl50μl20μl200μl200μl1000μl)。 

  4.3.2样品检测分析区:流式细胞仪或CD4检测分析仪及配套设备、打印机。 

5  常规CD4+ 和CD8+T淋巴细胞检测的方法和程序

5.1 样品采集、运输和接收

  5.1.1  样品采集 

  5.1.1.1选择合适的抗凝剂,用于血液学检测或流式细胞仪的免疫表型检测。 

  1)用于血液学检测的抗凝剂:K3EDTAK2EDTA抗凝管,在血球分析仪生产商允许的样品采集时间范围内检测。 

  2)用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂:K2EDTAK3EDTA酸性枸橼酸葡萄糖溶液(ACD)或肝素抗凝。一般要求48小时内染色,染色后6小时内分析。如采血后24小时内染色,则可在染色后24小时内分析。如果利用CD45单克隆抗体和侧向光设淋巴细胞门,可检测放置72小时的样品。 

  5.1.1.2 采血管上注明样品编号、采集日期等信息。 

  5.1.1.3 采集静脉血,注入已加入适当抗凝剂的采血管(有条件者最好用真空采血管)。采血后立即握住试管两端,垂直颠倒混匀数次,防止血液凝固。 

  5.1.2  样品运输 

  5.1.2.1 运输感染者样品至检测地点应符合国家《病原微生物实验室生物安全管理条例》相关要求。 

  5.1.2.2 在室温(1825℃)保存和运输样品,避免极端温度(结冰或大于37℃)。高温季节,需用隔热容器盛装样品,并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。 

  5.1.3  样品接收及保存 

  5.1.3.1专人接收样品,检查样品质量、数量并核对标识。 

  5.1.3.2溶血、凝血或结冰的样品应视为不合格样品,超过检测允许时间的样品不可检测。 

  5.1.3.3 如果样品运输过程中温度超出室温范围(1825℃),但没有明显的溶血或结冰,可以处理样品,但要在工作表的报告上注明温度条件。不能立即加热或冷冻样品以使其达到室温,否则会影响免疫表型检测结果。 

  5.1.3.4  用于CD4+T淋巴细胞检测的全血应保存在室温,48小时之内完成检测。如果用CD45圈门,可延长保存时间至72小时。 

5.2 方法

  目前,CD4+CD8+T淋巴细胞计数的方法分为两大类,一类是应用流式细胞仪测定法,另一类是非流式细胞仪测定法。常用的淋巴细胞计数检测方法为自动检测方法,包括流式细胞仪(主要有双平台法和单平台法)和专门的细胞计数仪。 

  5.2.1流式细胞仪检测方法 

  5.2.1.1双平台方法是一种细胞群体的绝对计数方法,利用血球计数仪检测淋巴细胞数量,再根据流式细胞仪得到的细胞群体百分比,计算得到每微升的淋巴细胞数量,这种方法叫做双平台方法。双平台法需要两种仪器,由于仪器有系统误差,计算结果的重复性和准确性影响因素较多,用这种方法进行CD4+CD8+ T淋巴细胞计数时,不同实验室差异很大。这种方法最大的缺点在于操作步骤复杂,操作人员多、费时,因此,很难将变异水平减小到最低。 

  5.2.1.2单平台方法是相对双平台法而言的,即应用三色、四色流式试剂配以内参绝对计数微球,加上流式细胞仪淋巴细胞亚群获取和分析软件,一步即可获得T细胞亚群的相对数(百分比)和绝对数。通过使用已知数量的参考微球为内参,可以直接报告绝对计数,即通过获取的目标细胞与参考微球的比例、参考微球数量和样品体积,得到每微升的淋巴细胞数量,也可用体积法获得CD4细胞绝对数。单平台法最大程度地减少了多个仪器检测带来的检测误差,细胞绝对计数结果的重复性和准确性都得到了良好的保证。 

  5.2.2非流式细胞仪测定法 

  5.2.2.1 Cyto-Spheres方法CD4+计数试剂盒包含CD4+微球试剂,即包被有单克隆抗体的惰性乳胶微球,可以通过光学显微镜鉴别和手工计数新鲜全血中CD4+T淋巴细胞的绝对数。其原理是人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体,因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中,以绵羊红细胞最为常用。 

  5.2.2.2 Dynabeads方法以免疫磁珠细胞分离方法为基础,使用包被CD4+CD8+抗体的Dynabeads磁珠,从全血中捕获分离CD4+CD8+T淋巴细胞;另一种CD14微球用来阻隔单核细胞。用龙胆紫和胎盘兰染色分离出来的CD4+T淋巴细胞,在光学显微镜下或自动细胞计数仪上计数。 

  5.2.2.3  荧光免疫成像技术是不同荧光染料标记的CD3+CD4+抗体与血液中相应的受体结合,通过特定的软件以及成像系统,仪器会自动分析并计数样品中的CD4+ T淋巴细胞绝对值。 

5.3  试剂

  5.3.1  荧光素标记的单克隆抗体 

  用荧光素标记的单克隆抗体,CD45CD3CD4CD8 

  5.3.2  单抗对细胞的反应性 

  CD45表达于所有白细胞;CD3表达于T淋巴细胞;CD4表达于T辅助/诱导淋巴细胞(CD4+T细胞)和单核细胞;CD8表达于细胞毒T细胞 

  )和单核细胞;CD8表达于细胞毒T细胞。 

5.4实验资料的记录

  5.4.1  及时、准确地记录实验结果。 

  5.4.2  实验记录中应包括以下内容:日期、操作者、所有样品信息、实验内容、过程(步骤)、结果及有无事故等。 

  5.4.3  所有实验资料应统一由专人负责,按固定格式记录在案。 

  5.4.4  计算机生成的实验结果,存档备案;定期将计算机结果文档备份并备案保存。 

5.5  结果报告

  5.5.1  多平台法用淋巴细胞总数(来自于WBC及分类)乘以淋巴细胞亚群百分率(从流式细胞仪数据中得到),计算绝对数值。 

  5.5.2  单平台法由计算机软件直接出结果并打印出报告单,报告单的内容包括如下结果:CD45+ Abs CntCD3+ Abs CntCD3+CD4+ %T LymCD45+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ %T LymCD3+CD8+ Abs CntTh/Ts及其正常参考值范围。 

  5.5.3结果报告单中应附有正常值参考范围(例如,CD4+T淋巴细胞绝对数和百分数)。注意用于CD4+T淋巴细胞检测的不同仪器有不同的正常值范围,成人及不同年龄段儿童正常值范围亦不相同。最好由国家或省市级实验室建立当地人群的成人和儿童正常值参考范围以供参考。按照实验结果填写CD4+ CD8+T淋巴细胞检测报告单,单平台法检测结果报告格式参见附表5 

  5.5.4  报告单经检测者和复核者签字,加盖检验单位公章后发出。应在检测完成后3个工作日内发出报告。 

  5.5.5  报告发放时,可经挂号邮寄或直接交给送检人。 

6  质量控制

  6.1 CD4+ CD8+T淋巴细胞检测的质量控制包括室内质量控制(简称室内质控)和外部质量控制(简称外部质控)。 

  6.2 室内质控要求工作人员做好仪器质控和过程质控。 

  6.2.1 仪器质控为应用仪器生产厂家的质控品校准仪器,每次开机应先进行质控品检测,质控品通过测试后方可检测样品。 

  6.2.2过程质控主要包括试剂质控、样品质控和数据质控。 

  6.2.2.1试剂质控要求所用试剂应在有效期内等。 

  6.2.2.2样品质控包括正确的样品采集、运输、接收、贮存、处理、分析方法以及室内质控的应用。稳定的全血样品可用于室内质控。通过每日绘制质控图检查实验质量,帮助分析和判断样品处理、仪器的准备和分析是否均处于最佳状态。 

  6.2.2.3数据质控包括正确的数据分析、结果报告、数据储存及对数据的可靠性分析。 

  6.3外部质控是有组织地系统质控测量。是由具有外部考核经历,并且检测质量获得改进的实验室之间进行相互质量参比,从而提高实验室结果的可比性,确保在所有实验室CD4+T淋巴细胞检测都有良好的高度一致的结果。国家艾滋病参比实验室负责制订和发展外部质控相关技术标准,并负责组织检验能力验证(PT)计划的实施,每年至少1-2次,每次2支质控品。有条件的实验室可参加国际认可机构的质控。具体参见《艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测及质量保证指南》第七章,实验室能力验证。 


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