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第九章 HIV-1的分离培养

1  范围

  本章规定了HIV1体外分离培养的方法和用途。 适用于对人血液和其他样本中HIV的分离培养。 

2  规范性文件引用

  NIAIDVirology Manual for HIV Laboratory, NIH Publication, No.97-3828.Jan 1997 

3  HIV-1分离的意义

3.1  HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断及诊断

3.2  HIV表型耐药检测及其他HIV生物学特征的研究。

3.3  HIV 感染的辅助诊断HIV-1感染窗口期。

4  实验室要求

4.1  实验室:经过认可的生物安全3级实验室。 

4.2  设备:生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机(配水平转头)、压力蒸汽灭菌器、液氮罐、-80℃冰箱、酶标仪等。 

4.3  材料:HIV阴性者抗凝全血、淋巴细胞分离液、细胞培养液(RPMI1640)、胎牛血清、白细胞介素-2IL-2)、植物血凝素(PHA)、HIV-1P24抗原检测试剂或逆转录酶检测试剂。细胞培养瓶、细胞培养板、吸管等。 

5  HIV-1分离的方法及程序

一般采用靶细胞(HIV阴性者外周血淋巴细胞,PBMC)与受检者标本(PBMC、全血、血浆、精液及其他体液)共培养的方法,最常用的方法是PBMC共培养。

5.1  样本:首选新鲜抗凝全血,也可以使用血浆、精液及其他体液。 

5.2  靶细胞制备:取HIV阴性者的抗凝全血,采用密度梯度离心的方法分离PBMC,并在含有适量天然白介素-2IL-2)和植物血凝素(PHA-P)的培养基中培养3天,使淋巴细胞由静止状态充分活化。 

5.3  建立共培养:将靶细胞与待检样本混合,在合适的条件下培养,培养过程中适时换液或补加新鲜靶细胞,维持培养28天。 

5.4  监测病毒生长:定时取适量培养上清液,检测HIV-1P24抗原或逆转录酶活性。也可定期观察细胞的形态,看有无HIV特征性的合胞体或其他细胞病变。 

5.5  病毒鉴定:取培养上清液提取纯化RNA,或取共培养的PBMC提取纯化基因组DNA,用PCR方法扩增HIV-1特征性基因片段,对扩增阳性的片段进行基因序列测定。 

5.6  判定结果和解释 

  5.6.1  培养上清液P24抗原或逆转录酶连续2次呈阳性反应、并有P24抗原含量/逆转录酶活性升高,或同时出现HIV特征性细胞病变,并经鉴定为HIV 基因序列,判为HIV-1分离阳性。 

  5.6.2  培养上清液P24抗原或逆转录酶始终为阴性,判为HIV-1分离阴性。 

  5.6.3  HIV-1分离培养阳性可以确证为HIV-1感染,分离培养阴性不能排除HIV-1感染。 

6  质量控制

  6.1  技术人员应接受HIV分离培养技术操作和生物安全3级实验室使用的专门培训,掌握基本的细胞培养技术。 

  6.2  必须在生物安全3级实验室的生物安全柜内操作,使用塑料的细胞培养瓶和吸管,遵守生物安全操作规程。 

  6.3  受检者样本必须无菌,培养过程中注意无菌操作。 

  6.4  制备靶细胞时使用多人PBMC混合、去除受检者PBMC中的CD8+T细胞有助于提高分离成功率。 

  6.5  可同时接种一株已经分离成功的HIV-1原代毒株,以证明实验方法的可靠性。 


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